Revista de Divulgación Científico-Tecnológica del Gobierno del Estado de Morelos

Quinta Generación de anti-venenos contra la picadura de alacrán

Dr. Baltazar Becerril Luján
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Dra. Lidia Riaño Umbarila
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Instituto de Biotecnología de la UNAM


Los venenos de alacranes son una mezcla compleja de sustancias, muchas de las cuales no son tóxicas a los humanos. Los componentes tóxicos son principalmente péptidos, moléculas que se encuentran en la naturaleza y son responsables de un sinnúmero de funciones. De un peso molecular aproximado de 7 mil unidades, las principales toxinas se distribuyen rápidamente a través del torrente sanguíneo llegando a los canales iónicos, componentes esenciales en la actividad de todas las células, por ejemplo el canal de Sodio (Na). Allí modifican la actividad de los canales causando una serie de síntomas de intoxicación, los cuales pueden llegar a causar la muerte. La neutralización de estas moléculas debe ocurrir en el menor tiempo posible, para evitar la muerte del paciente.

Desde hace aproximadamente 100 años, se tiene conocimiento de los antivenenos de primera generación, utilizados contra la picadura de alacranes, los cuales se obtenían al inyectar veneno en caballos, los cuales generan anticuerpos contra el veneno. Secando el suero de los caballos inmunizados en frío y al vacío, transformándolo en polvo, envasándolo en una ampolleta, una vez valorada la potencia del antiveneno, era aplicado a los pacientes. Ésta generación de antivenenos, provocaba en algunos de los picados una hipersensibilidad, debido a la presencia de altas concentraciones de proteínas extrañas, que dependiendo del individuo podía ser mortífera.

Ante esta situación, los científicos se vieron obligados a mejorar los antivenenos de primera generación, creando la segunda generación, en donde descubrieron que si el problema era la gran cantidad de proteínas tendrían que purificar los anticuerpos o inmunoglobulinas del suero de los caballos. Sin embargo, las consecuencias seguían siendo similares las de la primera generación, lo cual los orilló a realizar investigaciones que les ayudaron a determinar que segmento de los anticuerpos ocasionaba el problema. Dicha porción del anticuerpo resulto ser el “fragmento cristalizable (Fc)”, el cual fue eliminado por métodos bioquímicas, logrando de esta manera, eliminar las reacciones secundarias.

Este ultimo esfuerzo dio lugar a la tercera generación de antídotos conocida como faboterápicos, conteniendo diversos fragmentos de anticuerpos de caballo, dirigidos contra todos los componentes del veneno (incluyendo componentes no tóxicos). Para lograr la neutralización de los compuestos tóxicos en pacientes intoxicados, se administra el antiveneno, lo cual implica introducir altas concentraciones de anticuerpos extraños al organismo. Pensando en el mejoramiento de la terapia actual se decidió crear un nuevo antiveneno más específico y seguro. Este último irá dirigido exclusivamente contra las toxinas más abundantes y tóxicas de las especies más ponzoñosas de alacranes mexicanos.
Para lograrlo, hubo el interés de “humanizar” los anticuerpos de diferentes especies de animales, desarrollando la cuarta generación, es decir anticuerpos “humanizados”.


Dado que un anticuerpo completo es una molécula de tamaño considerable (150 mil de peso molecular) y de estructura modular, decidimos trabajar el fragmento variable de cadena sencilla (scFv por sus siglas en inglés), que en español significa fragmento variable de cadena sencilla de 25 mil de peso molecular, dando pié a la quinta generación. Tratándose de anticuerpos recombinantes de origen humano producidos en bacterias, Al tratarse de un antiveneno de origen humano, reduce al mínimo la posibilidad de reacciones adversas posteriores a la administración del antiveneno.
El scFv (Fig. 1) mantiene la capacidad de reconocimiento al antígeno, similar a la de un anticuerpo completo, pero es más fácil de manipular. Este formato tendría varias ventajas frente a los anticuerpos completos debido a que tiene una más rápida distribución en el organismo, pero también una mayor eliminación de las toxinas unidas al mismo. En caso de ser necesario, el scFv se puede transformar en otros formatos como por ejemplo un Fab (Fig. 1), el cual además de las regiones variables contiene una region constante unida a su respectiva región variable.

A través de metodologías como la exposición de estos scFvs en la superficie de virus bacterianos (despliegue en fagos) y la mutagénesis aleatoria del DNA aunado a una selección dirigida (evolución dirigida), hemos obtenido anticuerpos neutralizantes de los principales componentes de dos especies de alacranes mexicanos peligrosos. Para ello se construyó un banco (repertorio o colección) de anticuerpos humanos in vitro. Este proceso se inicia con la clonación de los segmentos de ADN que codifican para las regiones variables de las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) de los anticuerpos (todo esto a partir de ARN codificante de los linfocitos B de sangre periférica). Las regiones variables se unen por medio de un segmento conector (Figuras 1 y 2). Una vez unidas las cadenas pesadas y ligeras, éstas se producen en un cultivo de bacterias y de esta manera se obtiene el conjunto de fragmentos de anticuerpos humanos, llamado banco de anticuerpos desplegados en fagos, lo cual permite utilizarlo para seleccionar anticuerpos que reconocen a algún antígeno. Debido a que en el interior de la partícula viral se encuentra la información genética que codifica para la proteína desplegada, al aislar un fago-anticuerpo que se une específicamente a un antígeno determinado podemos saber de que tipo de anticuerpo se trata.
Cuando los anticuerpos seleccionados no tienen la afinidad requerida pueden ser sometidos a procesos de mutación y selección (evolución dirigida) para incrementar su unión al antígeno (afinidad mejorada). Los anticuerpos obtenidos en este proceso son evaluados en términos de su capacidad para neutralizar el efecto de las toxinas y/o del veneno total en ratones. De la misma forma es posible modificar la capacidad específica de reconocimiento de un anticuerpo para reconocer a otras toxinas semejantes.

Eliminando el efecto tóxico de venenos de alacranes mexicanos

De la manera descrita, hemos logrado generar fragmentos de anticuerpo humanos capaces de neutralizar el efecto de las toxinas más abundantes y tóxicas de dos venenos de alacranes mexicanos. Al neutralizar el efecto de las principales toxinas también es posible neutralizar el efecto del veneno completo. Hemos realizado avances importantes en la búsqueda de anticuerpos neutralizantes del veneno de una tercera especie venenosa. Los resultados son prometedores y representan una alternativa a la producción tradicional de antivenenos, debido a que es posible generar un antiveneno altamente específico y eficiente, pero sobretodo, de origen humano. Por las razones descritas, los scFvs humanos pueden ser considerados como la quinta generación de antivenenos (la cuarta generación corresponde a los anticuerpos humanizados provenientes de diferentes especies). Son escasos los trabajos reportados sobre el empleo de bancos de anticuerpos humanos para el aislamiento de scFvs contra los componentes tóxicos de venenos de animales peligrosos.

En este sentido México es pionero de este tipo de investigación, debido a que los principales logros los realizan las compañías farmacéuticas multinacionales, establecidas en Europa principalmente.
En conclusión, para diferentes fines terapéuticos, los bancos de anticuerpos humanos pueden ser la mejor fuente de antivenenos, debido su carácter homólogo y a la eliminación de las reacciones alérgicas secundarias.



Figura1. Formatos de anticuerpos


Figura 2. Descripción general de la obtención del repertorio de segmentos de ADN que codifican para los anticuerpos y su posterior despliegue en fagos.


Centrurioides limpidus limpidus

Centruroides noxious

 


El Dr. Baltazar Becerril Luján es Investigador Titular “B”. Jefe de Grupo en el Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos del Instituto de Biotecnología de la UNAM. Es uno de los líderes en la manipulación a anticuerpos y del sistema de despliegue en fagos en México. Posee una línea de investigación adicional sobre la influencia de la estabilidad termodinámica de la región variable de la cadenas ligeras lambda 6a, sobre la deposición de las mismas en forma de fibrillas en órganos específicos, enfermedad conocida como amiloidosis AL.

La Dra. Lidia Riaño Umbarila es investigadora en Estancia Posdoctoral en el grupo del Dr. Baltazar Becerril. Realizó su trabajo de Doctorado en la búsqueda de anticuerpos humanos neutralizantes contra la toxina Cn2 del alacrán Centruroides noxius. En su trabajo posdoctoral continúa con la selección de anticuerpos contra otra especies de alacranes peligrosas.